无菌检查法
http://www.100md.com
《制剂检查法概述》
制剂检查法 | |||
| 药材检定通则 | 药材及成方制剂显微鉴别法 | 生物制品通则 | 注射液中不溶性微粒检查法 |
| 溶液颜色检查法 | 澄清度检查法 | 易炭化物检查法 | 酸败度检查法 |
| 炽灼残渣检查法 | 大分子右旋糖酐检查法 | 崩解时限检查法 | 含量均匀度检查法 |
| 热原检查法 | 微生物限度检查法 | 无菌检查法 | 相对密度测定法 |
| 馏程测定法 | 溶出度测定法 | 水分测定法 | 氧瓶燃烧法 |
| 乙醇量测定法 | 羟丙氧基测定法 | 甲氧基测定法 | 干燥失重测定法 |
| 氮测定法 | 熔点测定法 | 凝点测定法 | 电泳法 |
| 有机溶剂残留量测定法 | 细菌内毒素检查方法 | ||
, http://www.100md.com
无菌检查法
无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。 无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。 生物制品应按卫生部《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基) 酪胨(胰酶水解) 15g 氯化钠 2.5g 葡萄糖 5g 新鲜配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml L-胱氨酸 0.5g (或新鲜配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml) 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.5～0.7g (或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml 酵母浸出粉 5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。 在无菌检查接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5。否则,须经水浴煮沸加热, 只限加热一次。
, 百拇医药
2.霉菌培养基 胨 5g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 1g 酵母浸出粉 2g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g 葡萄糖 20g 蒸馏水 1000ml 除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH约6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟。
3.选择性培养基 (1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查) 照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。
(2) 吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查) 照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加10ml的吐温80，摇匀后，分装， 115℃灭菌30分钟。
4.营养肉汤培养基 胨 10g 肉浸液 1000ml 氯化钠 5g 取胨与氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
, http://www.100md.com
5.营养琼脂培养基 照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
6.0.5%葡萄糖肉汤培养基 胨 10g 葡萄糖 5g 氯化钠 5g 肉浸液 1000ml 取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2， 分装，115℃灭菌30分钟。
7.霉菌琼脂培养基 照霉菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2,分装, 115℃灭菌20分钟，趁热斜放使凝固成斜面。 上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量约为试管高度的2/5，在115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30～35℃培养48小时，霉菌培养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。 培养基的质量应通过灵敏度检查。
培养基灵敏度检查法
, 百拇医药
1.菌种 (1)藤黄微球菌[CMCC(B)28001] (2)生孢梭菌[CMCC(B)64941] (3)白色念珠菌[CMCC(F)98001]
2.操作 取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的霉菌琼脂斜面的新鲜培养物分别用0.9%灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；将生孢梭菌的不含琼脂需气菌、厌 气菌培养基的新鲜培养物，吸入灭菌离心管，离心，弃去上清液,菌体用0.9%灭菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。分别取上述菌悬液用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度 标准管相同的浓度, 然后, 作10倍系列稀释并计数。
将藤黄微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分别接种至9ml试验培养基中,每个稀释度至少接种3管,以未接种的培养基管作对照，细菌试验管置30～35℃培养3天,白色念珠菌试验管置20～25℃培养5天。逐日记录结果。 3.结果判定 以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度(且接种菌量均应小于10个),三次试验中,以两次达到的最高灵敏度为判定标准。 需气菌、厌气菌培养基灵敏度为藤黄微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>；霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:10<6>。
, 百拇医药
【附注】 肉浸液制备法 取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后，每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g,加水1000ml，配成溶液代替。
对照用菌液 1.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液 取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至需气菌、厌气菌培养基内， 在30～35℃培养16～18小时后，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成1:10<6>。 2.生孢梭菌(Clostridium sporogenes)菌液 取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<6>。3.白色念珠菌(Candida albicans)菌液 取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至霉菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<5>。
, 百拇医药
检查法
1. 直接接种法
(1) 供试品如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液, 任取供试品2支(瓶)以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面后,以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种对照用菌液1ml，供作阳性对照；取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照，另接种于霉菌培养基2管，供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量,应根据供试品的装量，按下列规定取用： 供试品装量 每管接种量 培养基分装量 2ml或2ml以下 0.5ml 15ml 2ml以上至20ml 1.0ml 15ml 20ml以上 5.0ml 40ml 接种后轻轻摇动,使匀。需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5日, 霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素类药品均培养7日，放射性药品培养5～7日。培养期间应逐日检查是否有菌生长(阳性对照在24小时内应有细菌生长)；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀,经培养后不能从外观上判断时，可取该培养液转种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
, 百拇医药
(2) 供试品如为注射用灭菌粉末或无菌冻干品，照该药品项下的规定或按该药品剂量项下的溶剂用量，加入灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液,使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
(3) 供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药，按各药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
(4) 供试品如为外科敷料，取供试品2个包装,以无菌操作拆开包装, 于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。
(5) 供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌使用的浓度；或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
(6) 供试品如为抗生素药品,取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下，取最大规格量2份,分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，分别等量接种于每管装量为40ml的培养基中。
, 百拇医药
(7) 供试品如为放射性药品，取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。
2. 薄膜过滤法
(1)供试品如为抗生素药品，取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下取最大规格量2份, 分别按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9%灭菌氯化钠溶液至少100ml或其他适宜的溶剂中, 摇匀, 以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内,减压抽干后, 用0.9%灭菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜3次,每次至少100ml；取出滤膜，分成4片，取3片分别放在3管各40ml需气菌、厌气菌培养基中，其中1管接种对照用菌液1ml,供作阳性对照，另1片放在霉菌培养基管中。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
(2) 供试品如为抗厌氧菌药品, 取规定量的供试品, 按上述方法经薄膜过滤器处理后，取出滤膜，分成4片，其中3片放在3管需气菌、厌气菌培养基管中, 1管接种生孢梭菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。另1片放在霉菌培养基管中。 取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
, 百拇医药
(3) 供试品如为抗真菌药品，取规定量的供试品,按上述方法经薄膜过滤器处理后,取出滤膜，分成4片,取2片分别放在2管需气菌、厌气菌培养基管中；2片分别放在2管霉菌培养基管中，其中1管接种白色念珠菌对照用菌液1ml,供作阳性对照。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。 结果判断 当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管阴性时, 可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法倍量复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。
相对密度测定法
相对密度系指在共同特定的条件下,某物质的密度与水的密度之比。除另有规定外,温度为20℃。 某些药品具有一定的相对密度。纯度变更，相对密度亦随同改变。测定相对密度，可以区别或检查药品的纯杂程度。 液体药品的相对密度，一般用比重瓶(如图1或图2)进行测定；测定易挥发液体的相对密度时，可用韦氏比重秤进行测定。 比重瓶法 (1)取洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶(如图1)，装满供试品(温度应低于20℃或各药品项下规定的温度)后，装上温度计(瓶中应无气泡)，置20℃(或各药品项下规定的温度)的水浴中放置10～20分钟，使内容物的温度达到20℃(或各药品项下规定的温度)，用滤纸除去溢出侧管的液体，立即盖上罩。然后将比重瓶自水浴中取出，再用滤纸将比重瓶的外面擦干，精密称定，减去比重瓶的重量，求得供试品的重量后，将供试品倾去，洗净比重瓶，装满新沸过的冷水，再照上法测得同一温度时水的重量，按下式计算，即得。 供试品重量 供试品的相对密度＝──水重量 (2)取洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶(如图2)，装满供试品(温度应低于20℃或各药品项下规定的温度)后，置20℃(或各药品项下规定的温度)的水浴中，放置10～20分钟，插入中心有毛细孔的瓶塞，使过多的液体从塞孔溢出，并用滤纸将瓶塞顶端擦干，照上述(1)法，自“然后将比重瓶自水浴中取出”起测定，即得。 韦氏比重秤法 取20℃时相对密度为1的韦氏比重秤(图3)，用新沸过的冷水将所附玻璃圆筒装至八分满，置20℃(或各药品项下规定的温度)的水浴中，搅动玻璃圆筒内的水，调节温度至20℃(或各药品项下规定的温度)，将悬于秤端的玻璃锤浸入圆筒内的水中，秤臂右端悬挂游码于1.0000处，调节秤臂左端平衡用的螺旋使平衡，然后将玻璃圆筒内的水倾去，拭干，装入供试液至相同的高度，并用同法调节温度后，再把拭干的玻璃锤浸入供试液中，调节秤臂上游码的数量与位置使平衡，读取数值，即得供试品的相对密度。 如该比重秤系在4℃时相对密度为1，则用水校准时游码应悬挂于0.9982处，并应将在20℃测得的供试品相对密度除以0.9982。, 百拇医药